黃酮類化合物的合成生物學(xué)制造

章　黃酮類化合物簡介  001
1.1　黃酮類化合物  004
1.1.1　黃酮類化合物的基本特性  004
1.1.2　黃酮類化合物的種類  004
1.1.3　黃酮類化合物的功能及市場  007
1.2　黃酮類化合物的生產(chǎn)技術(shù)  010
1.2.1　黃酮類化合物提取法生產(chǎn)技術(shù)  010
1.2.2　黃酮類化合物化學(xué)法合成技術(shù)  014
1.2.3　酶催化生物合成黃酮苷  018
1.2.4　黃酮類化合物的微生物法生產(chǎn)技術(shù)  022

第二章　黃酮類化合物合成代謝途徑的挖掘與構(gòu)建  029
2.1　概述  029
2.1.1　黃酮平臺化合物柚皮素和生松素的合成代謝途徑  029
2.1.2　常見的黃酮類化合物修飾途徑  030
2.2　 組學(xué)技術(shù)驅(qū)動的水飛薊賓原生合成途徑的解析  032
2.2.1　不同植物組織水飛薊賓及其前體含量差異性分析  034
2.2.2　水飛薊賓合成過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析差異基因  036
2.2.3　體外仿生研究及水飛薊賓全合成途徑的解析  041
2.3　黃酮類骨架物質(zhì)合成途徑的異位重構(gòu)  047
2.3.1　基于定點突變技術(shù)的途徑基因挖掘  048
2.3.2　基于生物信息學(xué)分析的途徑基因挖掘  049
2.3.3　基于四質(zhì)粒共表達體系的合成途徑構(gòu)建與產(chǎn)物分析鑒定  049
2.4　大腸桿菌生產(chǎn)黃酮類物質(zhì)圣草酚的研究進展  051
2.4.1　大腸桿菌以L- 酪氨酸為底物生產(chǎn)圣草酚的機理  051
2.4.2　大腸桿菌生產(chǎn)黃酮類化合物圣草酚的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀  052
2.5　 代謝工程技術(shù)強化大腸桿菌胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的研究進展  053
2.5.1　丙二酰輔酶A 在圣草酚合成中的重要性  053
2.5.2　代謝工程技術(shù)強化大腸桿菌胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的研究現(xiàn)狀  053
2.5.3　代謝工程技術(shù)強化丙二酰輔酶A 的積累  054
2.5.4　 可溶性表達黃酮3' - 羥化酶（F3' H）融合蛋白及平衡相應(yīng)基因表達  057
2.5.5　重組菌的發(fā)酵條件優(yōu)化與控制  061
2.5.6　優(yōu)化條件下圣草酚產(chǎn)量與輔酶A 含量  064
2.5.7　基于高效黃酮3' - 羥化酶鑒定的黃杉素合成途徑的挖掘  066
2.5.8　SmF3H 的序列分析  067
2.5.9　SmF3H 的功能鑒定  069
2.5.10　基于啟動子優(yōu)化SmF3H 表達水平  069
2.5.11　在5L 發(fā)酵罐水平進行黃杉素發(fā)酵優(yōu)化  070
2.6　黃杉素從頭合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化  072
2.6.1　黃杉素及其微生物法合成  072
2.6.2　微生物法合成黃杉素的現(xiàn)狀與趨勢  072
2.6.3　微生物法高效合成黃杉素意義  078
2.6.4　黃杉素從頭合成途徑在解脂亞洛酵母中的重構(gòu)  079
2.6.5　黃杉素合成途徑限速步驟分析與模塊化優(yōu)化  082
2.6.6　通過強化前體代謝流提高黃杉素合成效率  084
2.6.7　發(fā)酵條件優(yōu)化  086
2.7　小結(jié)  087

第三章　黃酮類化合物從頭合成代謝途徑的構(gòu)建  089
3.1　 基于高效酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化體系的松柏醇全合成途徑的構(gòu)建  089
3.1.1　過氧化氫對香草醇氧化酶的抑制及松柏醇的過度氧化作用  090
3.1.2　過氧化氫酶的表達與分析  092
3.1.3　強化過氧化氫酶活性的松柏醇酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化體系分析  093
3.1.4　體系條件優(yōu)化及3L 發(fā)酵罐發(fā)酵  093
3.2　高效水飛薊賓體外合成新途徑構(gòu)建  096
3.2.1　過氧化物酶的選擇及其催化水飛薊賓合成的功能分析  097
3.2.2　酶級聯(lián)的設(shè)計與構(gòu)建  100
3.2.3　血紅素合成過程的強化  102
3.2.4　體外反應(yīng)條件優(yōu)化  102
3.3　基于限速分析的柚皮素從頭合成途徑的構(gòu)建  106
3.3.1　柚皮素從頭合成菌株的構(gòu)建  107
3.3.2　莽草酸途徑對柚皮素積累的影響  109
3.3.3　外源基因表達強度對柚皮素積累的影響  110
3.3.4　發(fā)酵罐水平優(yōu)化柚皮素積累  110
3.4　益生酵母的對香豆酸合成途徑的構(gòu)建  111
3.4.1　對香豆酸及其衍生物  111
3.4.2　對香豆酸及其衍生物的生物合成  113
3.4.3　釀酒酵母合成天然產(chǎn)物  119
3.4.4　產(chǎn)對香豆酸釀酒酵母工程菌株的構(gòu)建  122
3.4.5　釀酒酵母生產(chǎn)對香豆酸合成途徑的優(yōu)化  126
3.4.6　釀酒酵母生產(chǎn)對香豆酸的發(fā)酵優(yōu)化  131
3.5　基于酵母整合包的黃杉素從頭合成途徑構(gòu)建  135
3.5.1　構(gòu)建Ty 表達包  137
3.5.2　Ty 表達包的整合能力驗證  138
3.5.3　單位點Ty 整合菌株生產(chǎn)能力的鑒定  140
3.5.4　丙二酰輔酶A 途徑對柚皮素和黃杉素積累的影響  141
3.5.5　三位點Ty 整合菌株從頭合成黃杉素的能力  142
3.5.6　在5L 發(fā)酵罐中從頭合成黃杉素  144
3.6　小結(jié)  144

第四章　黃酮類化合物代謝途徑的理性調(diào)控策略  147
4.1　概述  147
4.1.1　微生物代謝途徑的傳統(tǒng)調(diào)控方法  147
4.1.2　微生物代謝途徑的精細(xì)調(diào)控策略  148
4.2　基于模塊化代謝途徑關(guān)鍵基因上調(diào)策略  148
4.2.1　黃酮骨架物質(zhì)總合成途徑的模塊劃分  148
4.2.2　黃酮骨架物質(zhì)總合成途徑的瓶頸步驟分析  149
4.2.3　特異模塊的精細(xì)劃分改造瓶頸步驟  150
4.2.4　模塊化的單獨優(yōu)化  151
4.2.5　芳香族氨基酸合成黃酮骨架物質(zhì)途徑的整合  152
4.3　基于內(nèi)源啟動子的基因上調(diào)策略  154
4.3.1　啟動子-5' - 非轉(zhuǎn)錄區(qū)域（PUTR）文庫篩選與準(zhǔn)備  154
4.3.2　PUTR 轉(zhuǎn)錄特性研究  157
4.3.3　細(xì)胞生長不同時期PUTR 蛋白質(zhì)表達特性研究  158
4.3.4　相同PUTR 熒光蛋白表達與mRNA 轉(zhuǎn)錄水平對比  159
4.3.5　啟動子工程構(gòu)建高強度PUTR  161
4.3.6　工程化PUTR 普適性研究  163
4.4　 基于反義RNA 的脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵基因下調(diào)策略  164
4.4.1　起始反義RNA 表達系統(tǒng)的構(gòu)建  165
4.4.2　反義RNA 不同結(jié)合區(qū)域?qū)σ种菩实挠绊?nbsp; 166
4.4.3　反義RNA 系統(tǒng)對于胞內(nèi)脂肪酸含量的影響  168
4.4.4　反義RNA 系統(tǒng)協(xié)同抑制fabB 和fabF 基因  168
4.4.5　反義RNA 系統(tǒng)對胞內(nèi)丙二酰輔酶A 濃度的影響  170
4.4.6　反義RNA 系統(tǒng)對柚皮素產(chǎn)量的影響  171
4.4.7　反義RNA 系統(tǒng)對生松素產(chǎn)量的影響  172
4.5　 基于CRISPR/dCas9 的中心代謝途徑關(guān)鍵基因下調(diào)策略  174
4.5.1　CRISPR 干擾系統(tǒng)的構(gòu)建  176
4.5.2　利用CRISPR 干擾系統(tǒng)鑒定出與丙二酰輔酶A 合成相關(guān)的基因  177
4.5.3　菌體生長和丙二酰輔酶A 合成的協(xié)調(diào)  178
4.5.4　單個基因抑制對于柚皮素產(chǎn)量的影響  181
4.5.5　多個基因抑制對于柚皮素產(chǎn)量的影響  182
4.5.6　單個或多個基因抑制對于生松素產(chǎn)量的影響  182
4.6　小結(jié)  184

第五章　黃酮類化合物合成過程的半理性調(diào)控策略  187
5.1　概述  187
5.1.1　黃酮及其中間代謝產(chǎn)物的高效檢測方法  187
5.1.2　微生物高效積累目標(biāo)產(chǎn)物的高通量篩選策略  187
5.2　 定向改造技術(shù)驅(qū)動的高效對香豆酸合成菌株的構(gòu)建  188
5.2.1　對香豆酸簡介  188
5.2.2　酪氨酸解氨酶的研究進展  189
5.2.3　定向進化方法概述  191
5.2.4　酪氨酸解氨酶高通量篩選方法的建立  192
5.2.5　隨機突變改造酪氨酸解氨酶  197
5.2.6　突變位點的單一及疊加突變與分析  201
5.3　 黃酮類化合物及其中間代謝產(chǎn)物的半理性篩選策略  205
5.3.1　柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的紫外- 可見光光波譜學(xué)特性  206
5.3.2　柚皮素、對香豆酸和L- 酪氨酸的熒光光譜學(xué)特性  206
5.3.3　柚皮素檢測條件優(yōu)化  208
5.3.4　中間產(chǎn)物干擾性驗證  209
5.3.5　TtgR 對柚皮素濃度響應(yīng)特性研究  210
5.3.6　基于TtgR 的超高通量篩選方法  211
5.3.7　質(zhì)粒文庫多樣性驗證  213
5.3.8　柚皮素高產(chǎn)菌株輪高通量篩選  216
5.3.9　柚皮素高產(chǎn)菌株迭代高通量篩選  217
5.3.10　柚皮素合成關(guān)鍵代謝節(jié)點解析  218
5.4　小結(jié)  219

第六章　黃酮類化合物生物合成途徑的動態(tài)調(diào)控策略  221
6.1　概述  221
6.1.1　代謝網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)調(diào)控策略  221
6.1.2　生物傳感器及其在代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的應(yīng)用  222
6.2　 基于CRISPRi 的脂肪酸動態(tài)調(diào)控黃杉素前體代謝途徑  223
6.2.1　隨機和定點整合方法的構(gòu)建  224
6.2.2　脂肪酸誘導(dǎo)型啟動子分析  228
6.2.3　sgRNA 單靶點阻遏效果分析  228
6.2.4　多基因組合阻遏效果分析  230
6.2.5　脂肪酸合成動態(tài)調(diào)控下黃杉素與脂肪酸合成  231
6.3　柚皮素合成過程的動態(tài)調(diào)控  232
6.3.1　柚皮素響應(yīng)啟動子結(jié)構(gòu)研究  233
6.3.2　對香豆酸響應(yīng)啟動子結(jié)構(gòu)研究  235
6.3.3　柚皮素動態(tài)調(diào)控模塊放大效應(yīng)  236
6.3.4　脂肪酸代謝途徑優(yōu)化  238
6.3.5　丙二酰CoA 來源代謝途徑優(yōu)化  240
6.3.6　雙動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)組合發(fā)酵  242
6.3.7　文庫構(gòu)建與轉(zhuǎn)化效率檢測  243
6.3.8　高通量篩選柚皮素高產(chǎn)菌株  243
6.4　小結(jié)  248

第七章　黃酮類化合物轉(zhuǎn)運途徑的發(fā)掘  251
7.1　概述  251
7.1.1　苯丙素類化合物簡介  251
7.1.2　利用大腸桿菌生產(chǎn)苯丙素類化合物的可行性及限制因素  252
7.2　膜蛋白質(zhì)組學(xué)  254
7.2.1　蛋白質(zhì)組學(xué)簡介  254
7.2.2　蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究技術(shù)及技術(shù)路線  255
7.2.3　蛋白質(zhì)組學(xué)在大腸桿菌中的應(yīng)用  258
7.3　 大腸桿菌AraE 蛋白對苯丙素類化合物轉(zhuǎn)運的情況  259
7.3.1　araE 基因過量表達和基因沉默菌株構(gòu)建及驗證  259
7.3.2　過量表達和沉默araE 基因?qū)Υ竽c桿菌苯丙素類化合物轉(zhuǎn)運的影響  260
7.4　E .coli BL21（DE3）膜蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳方法優(yōu)化  262
7.4.1　不同蛋白質(zhì)純化方法對雙向電泳結(jié)果的影響  262
7.4.2　不同凝膠參數(shù)的確定  263
7.5　 不同苯丙素類化合物刺激下E.coli BL21（DE3）膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果  264
7.5.1　不同苯丙素類化合物對E.coli BL21（DE3）膜蛋白表達的影響  264
7.5.2　差異表達蛋白質(zhì)的鑒定及鑒定結(jié)果分析  266
7.5.3　關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)的分析及定量PCR 驗證  269
7.6　E.coli BL21（DE3）中鑒定關(guān)鍵膜蛋白對苯丙素類化合物耐受性的影響  270
7.6.1　關(guān)鍵蛋白質(zhì)基因過量表達菌株的構(gòu)建  270
7.6.2　 過量表達膜蛋白基因?qū).coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響  271
7.6.3　關(guān)鍵蛋白質(zhì)基因沉默菌株的構(gòu)建  274
7.6.4　 沉默膜蛋白基因?qū).coli BL21（DE3）苯丙素類化合物耐受性的影響  277
7.7　小結(jié)  279

第八章　合成生物學(xué)制造黃酮類天然產(chǎn)物的工業(yè)化展望  281
8.1　化學(xué)品綠色制造核心技術(shù)——合成生物學(xué)  281
8.2　合成生物學(xué)與代謝工程育種新方法  281
8.2.1　代謝途徑精細(xì)調(diào)控策略的深入研發(fā)  281
8.2.2　合成生物學(xué)在微生物系統(tǒng)定向進化中的應(yīng)用  283
8.2.3　體外合成生物學(xué)的應(yīng)用  287
8.3　展望  290

參考文獻  292