輪狀病毒VP7基因植物表達技術(shù)研究

第1 章　輪狀病毒研究概況　1
1.1 輪狀病毒的危害 3
1.2 輪狀病毒的基本特性 4
1.3 輪狀病毒蛋白特征 5
1.4 輪狀病毒的血清學分類 8
1.5 輪狀病毒疫苗的發(fā)展概況 9
1.6 輪狀病毒疫苗的效果和有效性 15

第2 章　植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白研究進展及霍亂毒素B 亞基（CTB） 與連接肽介紹　17
2.1 植物生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白概況 19
2.2 植物生產(chǎn)藥用蛋白的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn) 24
2.3 植物生產(chǎn)藥用蛋白的技術(shù)平臺 27
2.4 植物生產(chǎn)疫苗 31
2.5 霍亂毒素 B 亞基（CTB）與連接肽 39

第3 章　輪狀病毒外殼蛋白VP7 在原核中表達的研究　43
3.1 原核表達材料和儀器設備 45
3.2 HRVVP7 基因序列合成及克隆載體構(gòu)建 51
3.3 構(gòu)建 pET-22b-HRVVP7 原核表達載體 55
3.4 HRVVP7 原核表達條件優(yōu)化及表達產(chǎn)物的存在形式 61
3.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 64
3.6 HRVVP7 純化 65
3.7 免疫印跡法檢測 66
3.8 基因序列合成及克隆載體構(gòu)建結(jié)果 67
3.9 pET-22b-HRVVP7 原核表達載體構(gòu)建結(jié)果 72
3.10 HRVVP7 原核表達條件優(yōu)化及表達產(chǎn)物的存在形式結(jié)果 73
3.11 HRVVP7 純化結(jié)果 75
3.12 蛋白免疫印跡檢測結(jié)果 77

第4 章　擬南芥表達輪狀病毒外殼蛋白VP7 的研究　83
4.1 擬南芥表達實驗材料及儀器準備 86
4.2 構(gòu)建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表達載體 90
4.3 轉(zhuǎn)化擬南芥與篩選 97
4.4 轉(zhuǎn)化擬南芥的分子生物學檢測 101
4.5 HRVVP7-linker-CTB 核酸序列合成及優(yōu)化結(jié)果 103
4.6 PCR 擴增 HRVVP7 核酸序列結(jié)果 105
4.7 pEASY -T1-HRVVP7 載體構(gòu)建結(jié)果 107
4.8 構(gòu)建pPhaP3301-HRVVP7-linker-CTB 和pPhaP3301-HRVVP7 植物表達載體結(jié)果 107
4.9 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及鑒定 110
4.10 擬南芥陽性植株的篩選 111
4.11 轉(zhuǎn)基因擬南芥在轉(zhuǎn)錄水平上的表達分析 113
4.12 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果 114
4.13 蛋白免疫印跡檢測結(jié)果 115
4.14 酶聯(lián)免疫吸附劑測定分析外源蛋白的表達量 116

第5 章　紅花種子表達輪狀病毒外殼蛋白VP7 的研究　123
5.1 紅花表達實驗材料及試劑準備 125
5.2 pPhaP3301-HRVVP7 質(zhì)粒凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 127
5.3 紅花的遺傳轉(zhuǎn)化 127
5.4 抗性苗嫁接 128
5.5 轉(zhuǎn)基因植株的基因組 PCR 鑒定 129
5.6 BCA 法測定紅花種子中總蛋白濃度 130
5.7 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測紅花種子中 HRVVP7 蛋白的表達 131
5.8 蛋白免疫印跡檢測紅花種子中 HRVVP7蛋白的表達 131
5.9 酶聯(lián)免疫吸附劑測定檢測紅花種子中HRVVP7 蛋白的表達水平 132
5.10 轉(zhuǎn)基因紅花苗的獲得 132
5.11 轉(zhuǎn)基因紅花葉片 PCR 檢測結(jié)果 133
5.12 BCA 測定總蛋白 134
5.13 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測種子蛋白表達結(jié)果 135
5.14 蛋白免疫印跡檢測種子蛋白表達結(jié)果 136
5.15 酶聯(lián)免疫吸附劑測定檢測種子蛋白表達水平 137

第6 章　轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的免疫學檢測　141
6.1 免疫檢測實驗材料及儀器準備 143
6.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株總蛋白量測定 145
6.3 動物免疫 146
6.4 小鼠產(chǎn)生 HRVVP7 抗體效價測定 146
6.5 抗體中和實驗 148
6.6 乳鼠攻毒實驗 149
6.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 150
6.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子總蛋白提取與蛋白含量測定 151
6.9 小鼠免疫后產(chǎn)生 HRVVP7 抗體效價測定 153
6.10 HRVVP7 抗體中和病毒效果分析 158
6.11 乳鼠攻毒后觀察統(tǒng)計 160

參考文獻　169

附錄　輪狀病毒相關(guān)知識簡介　183